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Mercredi 26 décembre 2012 3 26 /12 /Déc /2012 17:18

technobio 2013

Par Mr Magniez - Publié dans : biotechnologies - Communauté : Science
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Mercredi 14 novembre 2012 3 14 /11 /Nov /2012 14:00

La découverte de cette phytohormone:

En 1880, Francis Darwin étudie le phénomène de la courbure phototropique du coléoptile d'avoine. Chez les poacées, les feuilles sont cachées par une sorte d'étui appélée coléoptile. Lors de la germination le coléoptile est capable d'orienter sa croissance en fonction de la lumière. Cette capacité d'orientation s'appelle le phototropisme.

Il a ainsi pu observer qu'en plaçant une plantule dans une boite fermée et en perçant celle-ci d'un petit trou pour laisser entrer une lumière unidirectionnelle, le coléoptile se courbe vers la source de lumière. La phase opposée à la lumière croit plus vite que celle au contact de la lumière. Si on coupe le sommet du coléoptile, il n'y a plus de courbure, même chose si on place un cache sur le coléoptile.

Par ces résultats, il en conclue que le stimulus est produit  dans la partie haute du coléoptile et il est transmis vers le site d'action (la courbure) dans une partie plus basse.

 

darwin

 

En 1913, Boysen-Jensen sépare le coléoptile de la tige par un bloc de gélose. Il observe une courbure du coléoptile. Il en conclut que la substance induisant la courbure du coléoptile a migré à travers le bloc de gélose.  Il remplace le bloc de gélose par des blocs de mica, de platine et par du beurre de cacao. Il observe l'absence de courbure du coléoptile. Ils en conclue que la substance n'est pas de nature électrique, ni liposoluble. Cette substance est de nature hydrosoluble. 

 

En 1919, Arpad Paal et en 1923 Soding  placent la plaque de mica sur le coté de la tige opposée à la lumière. Ils observent un arrêt de la courbure. A l'inverse, si la plaque de mica est placée sur le coté de la tige face à la lumière, la courbure est conservée. Ils en concluent que la substance migre à des concentration plus importante du coté placé à l'obscurité par rapport à celui face à la lumière provoquant ainsi la courbure vers la source de lumière.

 

En 1926, Went dépose des bouts de coléoptiles sur un bloc de gélose. L'ensemble des coléoptiles et du bloc de gélose est ensuite déposé sur l'un des cotés de la tige préalablement décapitée. Le tout est ensuite placé dans une obscurité totale. Il observe la courbure de la tige du coté ou le bloc a été déposé. Il constate que l'angle de la courbure dépend  du nombre de sommet de coléoptiles. Il en conclue que la courbure est fonction de la concentration du messager. 

 

En 1931, Kogl et Haagen Smit identifient la structure chimique du messager qui porte le nom d'auxine (acide 3 indole acétique ou AIA). Il possède une chaine acétique et un noyau indole. 

 

Structure chimique:

Il existe 2 types d'hormones:

les hormones d'origine naturelle (elles sont produites par les plantes) sont  l'acide indole-3-acétique, l'acide 3-indole-butyrique et l'acide 4-chloro 3-indole acétique, de structures proches, ou encore l'acide phénylacétique qui ne présente toutefois qu'une faible activité auxinique. 

  auxineblog

Acide indole-3-acétique

Les hormones d'origine synthétique, l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l'acide 2-méthoxy-3,6-dichlorobenzoïque (Dicamba), l'acide 2,4,5-trichlorophenoxyacétique (2,4,5-T) ou encore l'acide 1-naphtalène acétique (1-ANA).   


Qu'elles soient naturelles ou synthétiques, le dénominateur commun à l'ensemble des auxines, semble résider dans la distance fixe (0,55nm) entre la charge négative portée par le carboxyle (sous sa forme dissociée) et une charge positive plus faible portée par le reste de la structure.  


Pourquoi utiliser des hormones d'origine synthétique? 

L'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique est une hormone puissante. Elle peut être utilisée comme herbicide. Si on dose fortement l'auxine, celle-ci induit la chute des feuilles.

En culture in vitro, le fragment de plante ne possède pas toutes les hormones lui permettant une régénération d'une plante entière. On utilise des hormones de type ANA, 2,4D qui sont stables et pour un coût moindre.

 

Utilisation d'hormones anti-auxine:

 Ce sont des molécules à structures proches des auxines  qui occupent les sites récepteurs de l’AIA ou un site particulier du récepteur sans induire la suite des événements et la chaîne de transduction du signal auxine.

Ces substances rentrent en compétiton avec l’auxine.
Exemple de composé anti-auxine: 2-4-6 trichlorophénoxyacétique.
 
Méthodes de dosage de l'hormone:
Le test de Went utilisé en 1926 (cf la découverte de cette hormone) est un test biologique puisqu'il dose la concentration de l'auxine en fonction de l'effet physiologique qui est l'intensité de la  courbure de la tige.
Cette méthode est très facile à mettre en oeuvre et pour un coût faible mais il est peu précis.On détecte de 10-4g/l à 10-5g/l.

La méthode immunologique consiste à doser la concentration de l'auxine grâce au test ELISA  on dépose dans un plaque multipuits l'extrait végétal contenant une certaine concentration d'auxine à doser. L'ensemble est placé à l'étuve afin que l'auxine s'attache sur le plastique. Ensuite on vide l'extrait. On amène les anticorps anti-auxinique qui reconnaissent la forme des molécules auxiniques et se fixent dessus. On procède à un rinçage. On dirige un deuxième anticorps  contre l'anticorps anti-auxinique. Cette anticorps possède une enzyme qui au contacte de son substrat incolore va interragir avec celui-ci et le colorer. Le dosage de la concentration de l'auxine est fonction de la quantité de l'anticorps anti-anticorps auxinique c'est à dire en fonction de l'activité enzymatique qu'il porte.La détection de l'activité enzymatique se fait à l'aide d'un spectrophotométre.
Cette méthode est beaucoup plus précise on détecte à 10-9 g/l.

La méthode HPLC (High-performance liquid chromatography) couplée avec un spectrofluorimétre. On fait traverser l'extrait végétal avec une certaine concentration d'auxine à doser à travers une colonne contenant un gèle de silice à l'aide d'un solvant (souvent du méthanol et de l'eau). Certains composés traînent dans la colonne d'autres passent plus vite. A la sortie le détecteur spectrofluorimétrique repère Les différents composés de notre extrait dont l'auxine à doser. Le résultat graphique apparaît sous forme de spectre fluorescent en fonction du temps de migration dans la colonne. Il suffit de repèrer le pic correspondant à l'auxine en réalisant un témoin à partir d'auxine commercial et par comparaison repérer le pic qui nous intéresse. La surface de ce pic et fonction de la concentration d'auxine dans l'extrait. On peut également utiliser un autre détecteur comme un spectromètre de masse.
Cette méthode est encore plus précise. On détecte à 10-12g/l. 

Localisation de cette hormone:
On estime que la concentration de l'auxine en moyenne est de 10-9g/g de tissus.
Ces sites de synthèse sont les bourgeons foliaires (méristèmes) et à moindre mesure dans les méristèmes racinaires et les tissus agés (feuilles adultes).
En général les cellules en division produisent des auxines et donc n'importe quelles cellules peuvent produire des auxines.


 Effets  physiologiques de cette hormone:
L'étude physiologique d'une hormone nécessite quelques règles à respecter:
  • Le choix de l'auxine: AIA; ANA; 2,4D. Attention, d'une hormone à l'autre les effets peuvent être différents.
  • Le choix du matériel végétal: l'espèce végétale; l'étude sur plante entière ou sur un fragment.
  • Le choix de la concentration de l'auxine: selon les concentrations les effets peuvent être différents.

  •  Elongation cellulaire:

L'auxine stimule l'auxèse (élongation cellulaire). elle active la production de pompes à protons. Ces pompes expulsent des protons dans le milieu extracellulaire ce qui fait diminuer le pH dans la paroi et augmenter le potentiel de membrane (la tension entre les deux côtés de la membrane est plus forte). Il s’agit de l’hypothèse « de la croissance acidodépendante ».L’acidification de la paroi a pour conséquence d’activer les expansines (enzymes) qui coupent les liaisons hydrogène entre les microfibrilles de cellulose et d’autres composants de la paroi cellulaire. L’armature de cellulose se relâche et les polysaccharides de connexion sont séparés, grâce aux enzymes de la paroi cellulaire qui peuvent y accéder plus facilement. La paroi devient plus extensible. L’efflux des protons favorise aussi l’entrée d’ions potassium qui vont, par un mécanisme d’osmose, induire l’entrée d’eau dans la cellule, d’où une augmentation de la pression de turgescence qui s’applique sur la totalité de la paroi par l’intermédiaire du cytoplasme. La cellule peut alors « s’étirer ». La cellulose synthase procède à la reconstruction de la cellulose. 

  • L'auxine stimule les pompes à protons  ATP dépendant en quelques minutes.
  • L'auxine stimule l'entrée d'eau dans la vacuole: elle stimule la synthèse des aquaporines (canaux protéiques à eau qui se trouve dans la membrane).
  • L'auxine joue un rôle sur l'orientation des microtubules.
  • L'auxine active la synthèse des enzymes comme la cellulose synthase en quelques heures.
  • L'auxine inhibe l'élongation des racines. A forte concentration, il y a synthèse d'éthylène dans la plante.
  •  La division cellulaire:

L'auxine stimule la division cellulaire, c'est à dire les mitoses en culture in vitro. Un fragment d'une plante placé dans un milieu nutritif contenant de l'auxine provoque l'apparition de cellules indifférenciées appelées cals. Les cellules d'un tissu différentié doivent se dédifférencier (perte de leurs spécialisations) puis entrer en mitose.

Cas particulier:

Le pouvoir rhizogène de l'auxine. Lorsqu'on place un fragment de racine dans un milieu contenant de l'auxine, on peut observer l'apparition de racines latérales et non une prolifération anarchique. 

Différentiation cellulaire:

L'auxine induit la formation du xylème et du phloème.

  •  Embryogénèse somatique:

  • Les tissus de l'hypocotyle (partie de la tige située entre sa base (collet) et les premiers cotylédons de la plante) en présence de 2,4D provoquent l'apparition de cals. Ces cals sont ensuite placés dans un milieu liquide sans 2,4D . Certains cals vont alors se diviser pour former un embryon sans qu'il n'y ait eu fécondation. Cet effet physiologique trouve son intérêt dans les laboratoires industriels. En effet, il est utilisé pour la sélection de nouvelles variétés.
  •  
  • Tropisme:

phototropisme

géotropisme = croissance orientée selon l'apesanteur.

Les statocytes sont des cellules spécialisées dans la perception de la gravité et situées au niveau de la coiffe des racines. Ces cellules sont caractérisées par la présence d’amyloplastes avec des grains d'amidons, spécialisés, appelés statolithes. Les statolithes sont donc des plastes, c’est-à-dire des organites intracellulaires, excentrés au pôle basal de la cellule par sédimentation (gravité). Ils exercent ainsi une pression sur la membrane des réticulums endoplasmiques, induisant une augmentation du calcium intra-cytoplasmique et l’activation des transporteurs de l’auxine. Les changements de répartition de l’auxine dans la racine provoquent ainsi des variations dans la croissance de celles-ci.

  • Dominance apicale:

Chez la plupart des plantes, les bourgeons axillaires situés juste sous le bourgeon apical ne se développent pas. Le bourgeon apical se développe rapidement vers le haut et les premières ramifications ne se réalisent sous ce bourgeon qu'à une certaine distance. La section du bourgeon apical provoque le développement immédiat des bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Tout se passe comme si, en fonctionnement normal, le bourgeon terminal exerçait une action inhibitrice sur les bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Ce phénomène est appelé la dominance apicale.

l'auxine appliquée sur la tige sectionnée au niveau d'un bourgeon apical évite le développement des bourgeons axillaires et donc maintient la dominance apicale exercée par le bourgeon apical. A partir de cette expérience, on peut déduire que le bourgeon apical exerce sa dominance par l'intermédiaire de l'auxine. Le bourgeon terminal secrète de l'auxine. Celle-ci circule vers le bas et inhibe le développement des bourgeons axillaires. La concentration d'auxine diminuant progressivement, l'inhibition s'exerce seulement sur une partie plus ou moins grande de la tige, variable selon les plantes.

L'utilisation de mutants auxotrophes pour le tryptophane, possède une dominance apicale faible ce qui conduit à un développement des bourgeons axillaires. La synthèse en auxine étant faible, le bourgeon apical ne peut exercer une inhibition.

  • Développement des fruits:

L'auxine stimule les divisions de l'ovaire.

L'auxine stimule la croissance des fruits.

expérience de Nitsch en 1950:

Si on supprime les akènes (vrais fruits) pendant la croissance de la fraise le faux-fruit (réceptacle floral) se développe peu, j'ai une inhibition de sa croissance.

Si on supprime les akènes d'un coté de la fraise et qu'on les laisse de l'autre coté, la fraise se développe de manière asymétrique. Plus fort développement du coté présentant encore des akènes.

Si on supprime tous les akènes de la fraise et qu'on applique de l'auxine sur le receptacle floral, la croissance de la fraise est normale.L’application d’auxine rétablit le développement de la fraise privée d’akène.

Si on applique de l'auxine sur le fruit en fin de croissance, le fruit murît: c'est la senescence du fruit. On stimule la synthèse d'éthyléne qui permet le murissement.

nitsch

  • Abscission (chute) des feuilles et des fruits:

Dans la partie basse du pétiole se trouve une zone responsable de la chute des feuilles appelée zone génératrice. Les cellules de celle-ci se dédifférencient et entrent en mitose, on obtient une sorte de méristéme où les cellules ont des parois fragiles: c'est la zone de rupture. En présence d'auxine, on inhibe la formation de cette zone génératrice, mais en excès,l'auxine stimule la synthèse d'éthylène et donc favorise la formation de cette zone.

  • Stress abiotique (stress du à l'environnement):

Exemples de stress:

O3 (ozone); UV; déficite hydrique.

En stress hydrique, la plante ferme ses stomates au niveau de l'épiderme des feuilles. La plante produit l'acide abscissique qui déclenche la fermeture des stomates. Les auxines ont l'effet opposé. Elles stimulent l'ouverture des stomates.

 

Par Mr Magniez - Publié dans : biotechnologies - Communauté : Science
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Lundi 8 août 2011 1 08 /08 /Août /2011 12:10

Definition:


Le transfert horizontal de gènes est un processus dans lequel un organisme intégre du matériel génètique provenant d'un autre organisme sans en être le descendant. Chez les bactéries, le transfert horizontal joue un rôle majeur dans leur diversification. Ce processus est considéré comme un des facteurs principaux de l'augmentation de la résistance des bactéries aux antibiotiques ainsi que la propagation des gènes de virulence.

 

Histoire:

 

 

  Michael Syvanen était parmi les premiers biologistes occidentaux pour explorer la signification potentielle du transfert transversal de gène. Syvanen a édité une série de publications sur le transfert horizontal de gène commençant en 1984, prévoyant que le transfert transversal de gène est un processus qui a formé l'histoire évolutionnaire dès le début de la vie sur terre.

 

Mécanismes  de transfert horizontal:

 

3 mécanismes en découlent:

 

La conjugaison bactérienne: elle consiste en une transmission de plasmides de conjugaison d'une bactérie donneuse à une bactérie receveuse . La bactérie donneuse posséde le plasmide facteur F, codant pour 24 gènes dont les protéines pilines constitutives des pili. Le facteur F est un épisome, car il peut s'intégrer dans le génome bactérien (souches Hfr).
  Lors de la conjugaison, la bactérie  donneuse (F+) ou Hfr va synthétiser des pili, qui vont lui permettre de s'arrimer à une bactérie receveuse ( F-).
  Le plasmide F va ensuite étre répliqué sous forme de simple brin, et la copie transférée vers la bactérie F- "reçeveuse". Comment a lieu ce transfert ? Longtemps considéré comme un canal de transfert, le pili serait maintenant vu comme une premiére étape d'arrimage, avant que les deux bactéries ne se rapprochent et que le transfert s'effectue par accolement des membranes.
  Lorsque l'épisome est inclu dans le génôme (souches Hfr), une partie du génôme bactérien est copié et transféré à la bactérie reçeveuse. Théoriquement, une copie totale du génôme devrait étre ainsi transférée. Mais ceci reste théorique, car la conjugaison n'est pas maintenue assez longtemps pour celà. Les gènes ont une probabilité de copie et de transfert plus forte s'ils sont situés à proximité de l'épisome.
  L'ADN simple brin transféré est ensuite transformé en double brin. Un double crossing-over permet d'intégrer les exogénes homologues dans le génôme de la bactérie reçeveuse. L'ADN exogéne linéaire après cet épisode ne peut se maintenir dans la bactérie, et finira par étre dégradée.
  La bactérie reçeveuse est devenue recombinante et a intégré des exogénes dans son génôme ou dans le plasmide F 

 

Les gènes codés par les plasmides de conjugaison confèrent diverses propriétés biologiques aux bactéries : résistance aux antibiotiques, résistance aux antiseptiques, résistance aux métaux lourds, résistance aux bactériophages, acquisition de facteurs de pathogénicité, acquisition de nouvelles propriétés métaboliques, synthèse de bactériocines etc.
Les plasmides de conjugaison (et les gènes portés par ces plasmides) peuvent se transmettre entre bactéries d'une même espèce, mais aussi entre bactéries d'espèces différentes.

 

 

Intérêt:

La conjugaison a permis d'étudier le groupe de liaison entre les gènes (linkage) et de dresser la carte génétique des bactéries.

 

  La transduction est un mécanisme lié aux bactériophages (virus spécifiques des bactéries): en effet, ces virus sont capables d'injecter leur génôme dans la bactérie pour qu'elle le réplique et le traduise. Selon les bactériophages, la transduction est un phénomène généralisé (n'importe quel gène est susceptible d'être transféré à une bactérie réceptrice) ou localisée (le transfert ne concerne que quelques gènes dont la nature est variable selon le bactériophage). Elle produit alors des particules virales, les copies du génôme sont encapsidées et la bactérie est lysée, laissant s'échapper les particules virales. On parle alors de cycle lytique.
  Mais le phage peut être tempéré, et suivre un cycle lysogénique. Dans ce cas l'ADN virale est injectée dans la bactérie et s'insére dans le génôme bactérien. Puis, suivant les conditions, l'ADN sera extrudé du génôme et engagera un cycle lytique.
  Lors de la lyse cellulaire, l'ADN génomique est morcellée, et il arrive que des fragments d'ADN soient encapsidés dans des capsides virales. On obtient alors un phage recombinant, qui, s'il infecte une nouvelle bactérie, ne créra pas de cycle viral, mais permettra une recombinaison homologue par exemple. Des génes peuvent ainsi être transférés de bactéries à bactéries via des phages communs.


  La transformation est un évènement assez mal expliqué. Il arrive que les bactéries incorporent de l'ADN et effectuent un événement de recombinaison. Dans d'autres cas, comme lors des applications biotechnologiques, on force la bactérie à incorporer un ADN plasmidique par électroporation. Les bactéries ainsi transformées pourront exprimer les gènes présents sur le plasmide.

 

Par Mr Magniez - Publié dans : biotechnologies - Communauté : Science
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Mardi 5 octobre 2010 2 05 /10 /Oct /2010 12:07

 

Mass Spectrometry ou MS est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse et de caractériser leur structure chimique

 

Histoire:

  • En 1910, le britanique Joseph John Thomson  conçoit la technique de spectrométrie de masse et met en évidence l'existence d'isotopes stables du néon.
  • En 1918, Arthur Jeffrey Dempster construit un spectrométre de masse à secteur magnétique.
  • En 1942, commercialisation du premier appareil.
  • En 1949, Herzog et Viehbok élaborent la spectrométrie de masse à ionisation secondaire connu sous le nom de SIMS (Secondary Ion Mass spectromtry).
  • En 1959, Roland Gohlke réalise le premier couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectromètrie de masse CG-SM.
  • En 1980, le thermospray.
  • En 1981, mise en place d'une technique de ionisation par bombardement d'atomes rapides connu sous le nom de FAB.
  • En 1985, Hillenkamp découvre  le MALDI (matrix-assisted-laser-desorption-ionization) qui permet d'effectuer le  séquençage de peptides.
  • En 1988, Fenn découvre la méthode d'ionisation électrospray qui permet les mesures de hautes masses moléculaires de peptides.

 

Principe:

Un composé organique introduit dans le spectromètre de masse est ionisé par bombardement électronique à 70eV. L'ion ainsi obtenu , appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé. Il peut y avoir des ruptures des liaisons chimiques au sein de l'ion moléculaire, formant ainsi des ions fragments caractéristiques puisque cette dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés. Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge par l'application d'un champ magnétique et/ou électronique, puis collectés par un détecteur. L'ensemble des ces ions fragments constitue le spectre de masse dont la lecture permet l'identification de la structure moléculaire.

 

La composition de base d'un spectromètre de masse: 

  • Un système d'introduction de l'échantillon
  • Une source d'ions ou chambre d'ionisation
  • Un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur masse et de leur charge
  • Un détecteur qui détecte les ions sortant de l'analyseur

 

 spectrométre de masse

  Chacun de ces élèments étant dans les conditions de vide. 

  • La première étape consiste à:

introduire l'échantillon dans la source d'ion. Cette introduction dépendra de l'état physique de l'échantillon (gaz, solide ou liquide).

  1. Pour les gaz et les liquides volatils, l'introduction s'effectue a l'aide d'un ballon chauffé mis en relation avec la source d'ion.
  2. Pour les solides, on utilisera une canne d'introduction possédant un filamment sur lequel on déposera l'échantillon préalablement dissout dans un solvant organique. L'échantillon peut être également introduit par un système séparatif comme la chromatographie en phase gazeuse, liquide, ou électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse.
  • La deuxième étape consiste à:

vaporiser les molécules et à les ioniser. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs type de sources existent et sont utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. 

 

  • L'impact électronique (EI-MS) consiste à obtenir, sous vide , l'interaction d'une molécule et d'un électron accéléré à quelques dizaines de volts. 
  • La ionisation chimique (CI-MS)  est une méthode qui utilise un gaz réactif (à la pression d'environ 1 mm Hg) qui est ionisé par un faisceau d'électrons et donne une série d'ions qui à leur tour réagissent avec les substances à analyser. On peut utiliser divers gaz, parmi lesquels l'ammoniac, le méthane et l'isobutane. 
  • L'electrospray est une technique qui permet de désolvater et d'ioniser, sous pression atmosphérique, les molécules d'échantillons dissoutes dans un solvant sous l'influence d'un champ électrique. 
  • La spectrométrie de masse à ions secondaires avec cible liquide (L.S.I.M.S) est une technique de désorption-ionisation par des ions rapides (Cs+ accélérés à 30kV) en présence d'une matrice liquides. 
  • Le bombardement par atomes rapides (F.A.B) est une technique dont le matériau à analyser est dissou dans une matrice liquide puis bombardé sous vide avec une énergie élevée par un faisceau d'atomes. 
  • La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est une technique permettant de ioniser un échantillon solide préalablement dispersé dans une grande quantité de matrice en l'irradiant par des photons émis par un laser dont la longueur d'onde est située dans la bande d'absorption de la matrice.


  • La troisième étape consiste à l'analyse: 

L'analyseur quadripolaire est constitués de 4 barres parallèles ayant idéalement une section hyperbolique, disposées symétriquement autour d'un axe. Ces 4 barres sont associées électriquement 2 par 2 et  créant ainsi un champ électrique d'oscillation laissant passer certaines masses tandis que d'autres sont sur une trajectoire instable ne leur permettant pas d'atteindre le détecteur. Le quadripôle est donc un filtre de masse.

  L'analyseur quadripolaire

 

 

L'analyseur à piégeage d'ions est un quadripôle à 3 dimensions constitué d'une électrode annulaire et de 2 électrodes "chapeaux" de sections hyperbolique. Le mouvement des ions en 3 dimensions à l'intérieur du piège dépend de la masse m de l'ion, ainsi que de sa charge Z. Il existe des zones de stabilité dans lesquelles des ions de masse m peuvent avoir un mouvement vibratoire stable et donc rester piégés dans la trappe ionique. Les ions sont d'abord tous piégés à l'intérieur de la trappe, confinés dans une certaine gamme de masse puis éjectés sélectivement en direction du détecteur. Le spectre de masse est obtenu en augmentant progressivement la tension pour destabiliser les trajectoires des ions en fonction de leurs masses croissantes.

trappe ionique

 

L'analyseur à temps de vol (time-of-flight, TOF-MS) est un système qui utilise la désintégration d'atomes de 252Cf  (isotope de californium qui est un puissant émetteur de neutrons ce qui le rend particulièrement dangereux. Chaque microgramme de 252Cf émet spontanément 2 314 000 neutrons par seconde) qui peuvent dans 3% des cas se désintégrer en deux particules Tc (Technétium) et Ba (Baryum) émises simultanément et dans deux directions opposées. L'une des deux est immédiatement détectée et donne un signal de départ, tandis que l'autre frappe une "cible" sur laquelle est déposé l'échantillon. Celui-ci va alors émettre de 1 à 10 ions secondaires, qui vont se déplacer à une vitesse inversement proportionnelle à la racine carrée de leur masse. Le temps qu'ils mettent pour atteindre le détecteur (= leur temps de vol) permet donc de déterminer la masse des ions.

  • Avantage: 

Cet analyseur offre la possibilité unique de détecter la présence simultanée d'un grand nombre de composés en mélange.

  • Limites:

La transmission, l'efficacité de détection décroît avec la vitesse pour les ions de haut poids moléculaire.
Cet technique nécessite de disposer d'un mode de production des ions impulsionnel afin de déclencher la mesure des temps de vol.

 

Les avantages de la spectrométrie de masse:

  • Sa versatilité
  • Sa sensibilité
  • Sa capacité à être couplée aux techniques séparatives

Les inconvénients de la spectrométrie de masse:

 

La mesure de masse ne peut être effectuée que sur la molécule isolée, il est donc nécessaire de transformer un échantillon généralement liquide ou solide en gaz dilué nécessitant un vide poussé.

 

Secteurs professionnels utilisant cette technique:

  • Hôpitaux
  • Musée (permet de mettre en évidence la présence d'huiles, de cires, de résines terpéniques, de gommes polysaccharidiques et de colles animales, à partir de micro-prélèvements effectués sur des œuvres d'art).
  • Aéroports
  • Laboratoires
  • Polices scientifiques
  • Archéométrie (datations; analyses élèmentaires et isotopiques; identifications de matériaux organiques complexes).

Son utilisation:

 

  • Identification :
    • Suivant le type d'ionisation utilisé, un spectre de masse peut être caractéristique d'une molécule. Ainsi en le comparant avec des banques de spectres, il est possible d'identifier la molécule.
    • Lors de l'utilisation d'un analyseur haute résolution (TOF, secteur magnétique, FTICR, Orbitrap), la spectrométrie de masse permet de mesurer avec précision la masse monoisotopique d'un ion et d'en déduire sa formule brute.
  • Analyse structurale :
    • La parité de la masse mesurée est fonction de la parité du nombre d’atomes d’azote que possède une molécule (règle de l’azote).

       

    • Chaque atome possède un ou plusieurs isotopes qui sont de masses différentes par définition. Ainsi, la proportion de chaque isotope observé sur un spectre de masse, c'est-à-dire le massif isotopique, est caractéristique de la présence de certains atomes et de leur nombre dans l'ion mesuré (en particulier: Cl, Br, qui présentent des isotopes M et M+2 en quantité notable).
    • Les ions peuvent se fragmenter dans un spectromètre de masse : dans la source d'ionisation, dans l'analyseur ou dans une cellule de collision. Comme les fragmentations respectent des lois précises de chimie en phase gazeuse, l'étude de ces fragments permet de déterminer la structure des ions.
  • Quantification :
    • Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Sa gamme linéaire va de 3 à 7 ordres de grandeur, d'où la possibilité d'obtenir une quantification fiable sur un domaine large.

 

 

Par Mr Magniez - Publié dans : biotechnologies - Communauté : Science
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Lundi 22 février 2010 1 22 /02 /Fév /2010 10:00
histoire:

Cette technique fut mise au point en 1984 par Osting O et Johanson K dans le but de détecter les cassures doubles brins de l'ADN. La lyse et l'électrophorèse fut effectuées dans des conditions neutres et la coloration avec de l'acridine orange (l'acridine se lie à l'ADN et à l'ARN grâce à ses propriétés d'intercalation).
Elle fut ensuite optimisée par Singh et all en 1988 afin de détecter les cassures simples brins et les sites alcali-labiles. L'électrophorèse, dans ce cas présent, se réalise dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé.


Principe:

Le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) est une technique d'électrophorèse sur microgel d'agarose. Il permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l'ADN tel que l'apoptose.

Mode opératoire:

Les cellules après un contact avec un agent altérant la structure de l'ADN (isotopes, agents oxydants ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné sont décollées de leur boite de pétri pour y être englobées dans un gel d'agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuites soumises à l'action d'un agent alcalin (pH 10)  qui a pour effet de lyser les cellules (destruction  des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dans un tampon d'électrophorèse  basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l'hélice et l'exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L'ADN ainsi relaché,  est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d'un intercalant fluorescent (le Bromure d'éthydium).
Si l'ADN n'a pas été  endommagé (reste sous forme super enroulé) sera révélé sous forme d'une sphère compacte.
Si l'ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins (plus légers) qui migreront en dehors de cette sphère formant un "halo" d'ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.
test des comètes
avantages:

  • Cette technique permet de quantifier d'une part les dommages causés à l'ADN par divers agents toxiques et d'autre part la réparation des dommages dans les cellules eucaryotes ainsi  que dans quelques cellules procaryotes in vivo et in vitro.
  • Technique non invasive.
  • Technique sensible (détection d'environ  0,2 à 2 coupures par 109 daltons).
  • Les résultats sont obtenus en quelques heures  par rapport aux techniques conventionnelles.
  • 50 à 100 cellules sont comptées par échantillon par comptage manuel ou en utilisant un logiciel.

inconvénients:

  • Le débit de cette technique est bas, car une électrophorèse correspond à un type cellulaire / un agent toxique / une concentration.
  • Les résultats ne peuvent être comparés que s'ils proviennent d'électrophorèses réalisées ensembles.
Exemples d'application:

  • Evaluation des produits chimiques génotoxiques in vivo et in vitro.
  • Etude sur la réparation de l'ADN (réparation par excision; Strand Break Repair).
  • Etude sur les dommages causés à l'ADN (cassure simple brin; sites alcali-labile; réticulation de l'ADN).
  • En éco-toxicologie: test utilisé pour surveiller des sols et étudier la toxicologie aquatique.
  • Evaluation des polluants génotoxiques provenant de sites de déchets dangereux.
  • Epidémiologie de l'homme:
    • Banque de sang.
    • Suivi de la radio et chimio-thérapie chez les patients cancéreux.
    • Banque de sperme.
Par par Mr Magniez - Publié dans : biotechnologies - Communauté : Science
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